中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部周叢照教授和陳宇星教授課題組，利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)解析了三種不同狀態(tài)的硝酸鹽/亞硝酸鹽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NrtABCD（縮寫為NRT）的三維結(jié)構(gòu)，包括結(jié)合底物硝酸根NO3-、結(jié)合Mg2+-ATP以及結(jié)合信號蛋白PII的結(jié)構(gòu)?；诮Y(jié)構(gòu)和生化分析以及生理實(shí)驗(yàn)，作者闡明了一種新型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物識別模式和轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán)，以及PII如何通過響應(yīng)不同的效應(yīng)分子進(jìn)而精細(xì)調(diào)控NRT轉(zhuǎn)運(yùn)活性的分子模型。相關(guān)研究成果以“Allosteric regulation of nitrate transporter NRT via the signaling protein PII”為題于3月8日在線發(fā)表于《美國科學(xué)院院報(bào)》上。
碳氮代謝平衡是細(xì)胞正常生長和處于穩(wěn)態(tài)的前提。藍(lán)細(xì)菌作為一種古老的光合自養(yǎng)型原核生物，進(jìn)化出由多種轉(zhuǎn)錄因子和信號蛋白調(diào)控的碳氮代謝網(wǎng)絡(luò)。其中，作為目前分布最廣泛的蛋白家族之一，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白PII響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)代謝小分子和能量的變化，進(jìn)而調(diào)控多種靶蛋白的活性，維持碳氮平衡。在銨鹽缺乏的情況下，藍(lán)細(xì)菌通過激活硝酸鹽同化通路將硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)并還原為銨，從而為其生長提供氮源。研究表明，PII能與硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT互作進(jìn)而調(diào)控硝酸鹽同化通路的活性。NRT由5個(gè)蛋白亞基組成：一個(gè)底物結(jié)合蛋白（SBP）NrtA、兩個(gè)相同的跨膜亞基（TMD）NrtB以及兩個(gè)不同的核苷酸結(jié)合亞基（NBD）NrtC和NrtD，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的I型ABC importer。與經(jīng)典ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不同，其NrtC亞基的C端融合了一個(gè)與NrtA相似的調(diào)控結(jié)構(gòu)域（CRD），被認(rèn)為可能參與調(diào)控NRT的活性。目前，關(guān)于這種新型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理，以及PII如何識別NRT進(jìn)而調(diào)控藍(lán)細(xì)菌碳氮平衡的分子機(jī)理仍不清楚。
作者解析了NrtBCD三種不同狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu)。其中，結(jié)合底物硝酸根的NrtBCD-NO3-結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)向內(nèi)開口（inward-facing）的構(gòu)象，TMD中存在一個(gè)由結(jié)合硝酸根的疏水腔和富含精氨酸殘基的親水腔組成的連續(xù)的底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道，負(fù)責(zé)底物的進(jìn)入和釋放。在結(jié)合Mg2+-ATP的NrtBCD-ATP結(jié)構(gòu)中，ATP的結(jié)合引發(fā)NBD相互靠近，導(dǎo)致TMD發(fā)生構(gòu)象變化，底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道被封閉，形成封閉的向外開口（outward-facing occluded）的構(gòu)象。NrtBCD-PII復(fù)合物結(jié)構(gòu)采用了一種完全不對稱的抑制型構(gòu)象（圖1）。與以前報(bào)道的PII通過T-loop結(jié)合靶蛋白的方式不同，NrtBCD-PII中的PII通過核心結(jié)構(gòu)域中的T-loop基部、B-loop和C-loop等元件同時(shí)結(jié)合NrtC的NBD和CRD結(jié)構(gòu)域，代表了一種新的相互作用模式。作者通過結(jié)構(gòu)分析結(jié)合生化生理實(shí)驗(yàn)提出了PII通過調(diào)控NRT活性進(jìn)而維持藍(lán)細(xì)菌碳氮平衡的分子模型（圖2）：在高N/C比時(shí)，PII通過與NrtC直接結(jié)合進(jìn)而與NRT形成復(fù)合物，將NRT鎖定為抑制型向內(nèi)開口（inhibited inward-facing）的構(gòu)象，同時(shí)跨膜區(qū)的底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道收窄，抑制了NRT的硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)活性。而在低N/C比時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的α-酮戊二酸（2-OG）累積，此時(shí)2-OG結(jié)合PII并導(dǎo)致PII發(fā)生構(gòu)象變化，使其從NrtC上解離下來，NRT轉(zhuǎn)運(yùn)活性得以恢復(fù)，向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽/亞硝酸鹽，維持碳氮平衡。本研究不僅闡明了信號蛋白PII與靶蛋白的一種新型互作模式，還發(fā)現(xiàn)了一種非對稱的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)控模式，拓展了藍(lán)細(xì)菌的碳氮代謝平衡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)周叢照教授、江永亮副教授和陳宇星教授為該論文的共同通訊作者，博士生李波為該論文的第一作者。冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集工作在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)冷凍電鏡中心完成。該研究工作得到中國科學(xué)院、國家自然科學(xué)基金委、科技部和安徽省科技廳的資助。
圖1.NrtBCD-PII復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)
圖2.PII調(diào)控NRT轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán)的模式圖
原文鏈接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2318320121
（生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部、科研部）
